Лабораторные методы выявления аллергии
Диагностика АЗ
Точный диагноз аллергии ставится только после комплексного обследования. Оно включает сбор анамнеза, а также результаты специфического аллергологического освидетельствования — кожных проб (после 3-х лет) и исследования сыворотки крови на содержание специфических иммуноглобулинов Е и G. Ловушки для аллергенов XXI столетие, согласно прогнозам ВОЗ, станет веком аллергии. По данным организации, заболеванием страдает пятая часть жителей планеты. Оно выявляется у каждого шестого американца и каждого четвертого немца. В России, в зависимости от региона, аллергиков 5–30%, Украине — 20–30%. А в Беларуси лишь 2–5%. Такая малая доля связана с недостаточной выявляемостью: как правило, люди с симптомами этой болезни годами не обращаются к специалисту, зачастую не связывают некоторые формы с аллергической природой (например, лечат насморк как простудный). Проявляться недуг может в виде бронхиальной астмы, конъюнктивита, поллиноза, дерматита, отека, крапивницы, холодовой аллергии...
Антонина МАРКОВА, научный сотрудник клинической лаборатории профпатологии РНПЦ гигиены На основании лабораторных методов выявляется причина заболевания и ставится диагноз, затем решается вопрос о применении лекарств или небулайзерной терапии и ингаляторов, дающих длительный контроль над астмой и восстанавливающих систему дыхания. Одновременно нужно максимально ограничить контакт с аллергеном. Назначается гипоаллергенная диета. Точный диагноз ставится только после комплексного обследования. Оно включает сбор анамнеза, а также результаты специфического аллергологического освидетельствования — кожных проб и исследования сыворотки крови на содержание специфических иммуноглобулинов Е и G. Кожные пробы (прик-тестирование, скарификационный, аппликационный и внутрикожные тесты) показаны для диагностики IgЕ-зависимых аллергических заболеваний и позволяют определить антигены, имеющие значение в развитии симптомов у конкретного пациента. Лабораторные методы расширяют возможности кожных проб. Определение общих и антигенспецифических антител иммуноглобулинов E позволяет обследовать больного в период обострения, когда он получает антигистаминные и кортикостероидные препараты, имеет высыпания на коже; у беременных с неспецифической кожной чувствительностью и т. д. В норме в крови здоровых людей содержится незначительное количество общего иммуноглобулина Е (20–120 Ед/мл). Показатель у страдающих аллергией значительно повышен. Это неспецифический маркер заболевания, который отражает степень общей аллерголизации организма. Определение антигенспецифических антител иммуноглобулинов Е позволяет выявить конкретные аллергены, на которые реагирует организм. Исследование иммуноглобулинов Е (общих и специфических антител) проводится на основе иммуноферментного (ИФА) или хемилюминесцентного анализа (MAST-теста). Метод очень чувствительный, а полученная информация схожа с результатами кожного тестирования. Количество аллергенов, к которым можно определить индивидуальную непереносимость, постоянно расширяется (в настоящее время насчитывается около 500 наименований). Псевдоаллергические реакции близки по клинической симптоматике с истинными IgE-зависимыми реакциями, но отличаются отсутствием первой иммунологической стадии, т. е. при них происходит высвобождение медиаторов: гистамина, лейкотриенов, простагландинов — и нет образования антител. Для диагностики предложены цитометрический аллергенстимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест), тест торможения миграции лейкоцитов (ТТМЛ), клеточный тест высвобождения медиаторов (ЕК-CAST). ЕК-CAST основан на определении сульфолейкотриенов — продуктов распада арахидоновой кислоты, которые могут синтезироваться базофилами, тучными клетками, макрофагами, эозинофилами не только при IgE-зависимых аллергических реакциях, но и при воспалительных процессах, лекарственной и пищевой непереносимости, псевдоаллергических реакциях. Сульфолейкотриены выявляются в биологических жидкостях методом ИФА. Тест считается положительным для пищевых, ингаляционных аллергенов, латекса, ядов насекомых при определении уровня лейкотриенов ≥200 пкг/мл; для лекарственных аллергенов, а также пищевых и химических добавок ≥40 пкг/мл. Данные методы очень чувствительны и высокоспецифичны. При пищевой и лекарственной непереносимости, в отличие от истинной иммуноглобулин-Е-зависимой аллергии, большое значение уделяется исследованию иммуноглобулинов-G-зависимых реакций (II и III типы реакции гиперчувствительности). Важную роль в формировании непереносимости к молоку, яйцам, рыбе играют иммуноглобулин-G4-антитела. Этому способствуют заболевания желудочно-кишечного тракта: гастрит, хронические холецистит и панкреатит, колит, дисбактериоз кишечника. Для диагностики используется метод ИФА. К наиболее информативным исследованиям при пищевой аллергии относятся также радиоаллергосорбентный тест (РАСТ) с использованием САР-system, MAST-CLA-system и др. Если после обследования диагноз остается неясным, врач может назначить провокационные тесты. Их проводят в аллергологических стационарах по строгим показаниям из-за вероятности тяжелых системных реакций (анафилактический шок и т. д.). Когда контакт с аллергеном постоянный, то для подтверждения клинических проявлений заболевания используют элиминационные тесты. Типичный пример — диета, при которой из рациона полностью выводится предполагаемый аллергенный продукт. Для диагностики патологии и коррекции лечения врач может попросить пациента вести специальный дневник, в котором отмечается время начала аллергии, ее проявление и возможная причина. Это позволит назначить профилактическое лечение или исключить контакт с аллергеном. ЦАСК-тест и ЕК-CAST при пищевой аллергии и непереносимости, а также псевдоаллергических реакциях могут применяться для составления гипоаллергенной и элиминационной диеты. На основании лабораторных методов выявляется причина заболевания и ставится диагноз, затем решается вопрос о применении лекарств или небулайзерной терапии и ингаляторов, дающих длительный контроль над астмой и восстанавливающих систему дыхания. Одновременно нужно максимально ограничить контакт с аллергеном. Для этого применяются воздухоочистители, средства борьбы с микроклещами. Подушки, одеяла, матрасы желательно заменить на синтетические, использовать специальные наматрасники, наволочки и пододеяльники, предотвращающие контакт с микроклещами. Назначается гипоаллергенная диета.
Доцент, к.м.н. Т.П. Маркова (Институт повышения квалификации Федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве России)
Возможности профилактики аллергических заболеваний изучаются более 10 лет, однако, во всем мире наблюдается рост аллергических заболеваний, а заболеваемость аллергическим ринитом приобретает эпидемические пропорции (3, 6, 8). Отечественная школа аллергологов, созданная А.Д.Адо, всегда уделяла и уделяет большое внимание профилактике и диагностике аллергических заболеваний (3).
Профилактические и диагностические мероприятия включают:
1. сбор анамнеза;
2. лабораторная диагностика аллергических заболеваний: скарификационные, prick- и контактные кожные тесты, внутрикожные тесты, определение общего и специфических IgE, цитометрический аллерген стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест), клеточный тест высвобождения медиаторов, ТТЕЭЛ – тест торможения эмиграции лейкоцитов, тест дозированной физической нагрузки для диагностики крапивницы физического напряжения);
3. цитологическое и бактериологическое исследование мазков из носа и зева;
3. диспансерное наблюдение в медицинском учреждении, включая наличие медицинской карты или истории болезни, паспорта больного аллергическим заболеванием;
4. элиминация аллергенов:
а) воздухочистители, специальные пылесосы;
б) средства борьбы с микроклещами (акаросан, акарил, акарекс–тест)
в) замена подушек, одеял, матрасов на синтетические, специальные наматрасники, наволочки, пододеяльники, предотвращающие контакт с микроклещами;
г) изменение места жительства на период воздействия аллергенов (пыльцевые аллергены);
д) гипоаллергенная диета
В настоящее время создана целая индустрия, занимающаяся проблемами элиминации аллергенов. Перечисленные мероприятия позволяют поставить диагноз аллергического заболевания уже на ранних этапах, что способствует профилактике и эффективному лечению данной патологии.
Остановимся более подробно на современных методах диагностики аллергических заболеваний. По данным разных авторов в различных странах аллергическими заболеваниями страдают 10-30% населения (3). По данным ГНЦ – Института иммунологии, г.Москва, около 40 000 больных в год амбулаторно обращаются по поводу аллергических заболеваний. В последние годы наблюдается рост заболеваемости поллинозами, аллергическим ринитом.
В 1967г. Johansson S. и Bennich H. был открыт и описан IgE, что привело к созданию тест-систем, позволяющих определить общий и аллерген-специфические IgE. Данный тест не уменьшает значимости скарификационных и prick-кожных тестов, они применяются для определения причинно значимых аллергенов перед проведением аллерген специфической иммунотерапии (АСИТ). У определенных больных проведение кожных тестов затруднительно (аллергодерматозы; пациенты, получающие антигистаминные или кортикостероидные препараты; дети, с низким порогом кожной чувствительности; беременные с неспецифической кожной чувствительностью). Аллергические реакции, в механизме развития которых задействован IgE, получили название «истинных» или IgE-опосредованных.
В настоящее время на рынке имеется большой выбор тест-систем различного производства для определения аллерген специфических и общего IgE количественным или полуколичественным методом на основе ИФА или хемилюминесцентного MAST-теста. Количественный метод хорошо отработан для определения общего IgE. При полуколичественном методе аллерген специфические IgE оцениваются по классам в зависимости от интенсивности реакции (1 класс –низкая интенсивность; 2 класс – средняя; 3-высокая; 4 класс – очень высокая). Интенсивность реакции 1 класса не учитывается, как положительный результат.
MAST-тест (фирма «Люминери»), по мнению многих исследователей, более специфичен, позволяет быстрее получить результаты исследования, можно определять параметры даже у 1 больного, не ожидая набора проб. Одним из примеров количественного метода являются тест-системы фирмы «Биохиммак», когда с помощью построения калибровочной кривой можно определить количественные параметры аллерген специфических IgE.
Результаты кожных проб не всегда совпадают с результатами определения специфических IgE, что связывают с более сложными механизмами формирования кожной реакции. Параллельные исследования результатов кожных проб и MАSТ-теста показывают довольно высокую корреляцию
по данным Горячкиной Л.А., Демборинской А.С., см. табл. 1 (2).
Табл. 1. Корреляция результатов кожных проб и MAST-теста.
Аллергены
Положительные результаты кожных проб
Положительные результаты MAST-теста
% положительных результатов MAST-теста к результатам кожных проб
Шерсть животных
22
20
90,9%
Клещ Dermatho-phagoides
18
16
88,8%
Грибы
7
4
57,14%
Пыльца деревьев
16
15
93,7%
Пыльца злаковых трав
13
13
100%
Пыльца сорных трав
11
10
90,9%
Пищевые
12
7
58,3%
Из данных таблицы видно, что несоответствие результатов кожных проб и MAST-теста касается грибковых и пищевых аллергенов.
По данным Лусс Л.В. ложноположительные результаты при применении MAST-теста отмечались в 6,4% случаев, что может быть связано с перекрестно реагирующими аллергенами (4).
Особого внимания заслуживают контактные кожные тесты, стандартизированные международной группой авторов в 1967г. (11). Контактный дерматит относится к реакциям гиперчувствительности IV типа (гиперчувствительность замедленного типа) и в своем развитии проходит фазу индукции (сенсибилизации) и клинических проявлений. Роль аллергенов здесь могут выполнять низкомолекулярные белки, соли металлов, гаптены, лекарства. Сенсибилизированные Th1 (CD4+-клетки) вырабатывают гамма-интерферон (ИФН), что приводит к активации кератиноцитов, экспрессии HLA-DR, ICAM-1 АГ, выработке ИЛ-2 и других провоспалительных цитокинов, вазодилятации и развитию местного воспаления. При контактных кожных пробах химические соединения (аллергены, сульфат никеля, неомицин, формальдегид и т.д.) инкорпорированы на пластинках из геля (поливинилпирролидон, гидрооксипропилцеллюлоза), которые закрепляются на спине больного. Стандартная пластинка содержит 24 аллергена (фирма «Фармация»), действующая доза измеряется в мкг/см2. Разработаны специальные стрипы для контакта с жидкими аллергенами, растворенными в петриоляте или масле, воде и т.д. Например, при аллергическом дерматите результат (размер бляшки в месте контакта) стрипы снимают и измеряют результат через 48 часов контакта (- реакции нет; ± - только эритема; + - эритема и инфильтрация; ++ - эритема и не более 3-х папул; +++ - эритема и более 4-х папул; ++++ - эритема и большое количество выраженных папул; +++++ - эритема, пузырьки). Тест используется для диагностики у взрослых и детей. Время чтения результатов может варьировать от 48 часов до 7 дней (поздняя реакция). Истинная аллергическая реакция формируется через 72-96 часов (11).
В России были разработаны аппликационные и капельные пробы, когда на предварительно обработанную 70% спиртом кожу предплечья наносят каплю аллергена или кусочек марли, обработанной аллергеном (3).
Большое внимание уделяется диагностике IgG-опосредованных аллергических реакций (II и III тип реакции гиперчувствительности), часто в литературе обозначаемых термином пищевой или лекарственной непереносимости, в отличие от истинной IgE-опосредованной пищевой и лекарственной аллергии. Важную роль в формировании пищевой непереносимости к молоку, яйцам, рыбе играют IgG4-АТ (3).Формированию пищевой и лекарственной непереносимости способствует наличие заболеваний желудочно кишечного тракта (ЖКТ): гастрит, хронический холецистит, хронический панкреатит, колит, дисбактериоз кишечника. Определение IgG-АТ к пищевым продуктам методом ИФА (фирма «Биохиммак», «Аллергофарма») целесообразно также при рецидивирующей крапивнице, атопическом дерматите, с наличием сопутствующих заболеваний ЖКТ. При целиакии наблюдается пищевая непереносимость глютен-содержащих продуктов (белок глиадин). В механизме развития задействованы активированные Т-клетки, вырабатывающие ИЛ-2 и другие цитокины (гамма-ИФН, ФНО-альфа, ИЛ-1), синтезируются специфические IgG, M, A-АТ, что приводит к повышению про-ницаемости и повреждению слизистой, а в дальнейшем к развитию атрофии (1).
Псевдоаллергические реакции по клинической симптоматике могут быть сходны с истинными IgE-опосредованными реакциями, но отличаются по механизму развития. Их развитие не связано с выработкой АТ или участием сенсибилизированных лимфоцитов, в патогенезе этих реакций выделяют только две стадии – патохимическую и патофизиологическую (3).
При псевдоаллергических реакциях происходит неспецифическое высвобождение медиаторов: гистамина, лейкотриенов, простагландинов. Вещества, приводящие к высвобождению медиаторов получили название гистаминолибераторов: вещество 48/80, полиамины, вещества, в составе которых имеются NH-группы или алифатическая связь N-гексадефиламид, антибиотики (полимиксин), кальциевые ионофоры, фрагменты комплемента, кровезаменители, продукты жизнедеятельности гельминтов (3).
Для диагностики псевдоаллергических реакций предложены цитометрический аллерген стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест) и клеточный тест высвобождения медиаторов (FLOW-CAST и EK-CAST). В 2002г. DeWeck A.L., Sanz M.L. показали, что при активации базофилов с помощью аллергена на их поверхности происходит экспрессия CD63 АГ (7). При ЦФСК-тесте (FLOW-CAST) используют двойную метку, выделяют лейкоциты и инкубируют их со стимулирующим буфером и аллергеном, анти IgE МАТ с флюоресцентной меткой для идентификации базофилов, после чего добавляют CD63 МАТ и на поверхности базофилов определяют экспрессию CD63 АГ методом проточной цитометрии. Например, для пищевых и ингаляционных аллергенов тест считается положительным при экспрессии CD63 на поверхности ³15% базофилов; для ядов насекомых - ³ 10%; бета-лактамных антибиотиков и анальгетиков- ³ 5% базофилов и индекс стимуляции ³ 2. Индекс стимуляции равен отношению %CD63+-базофилов в пробе с аллергеном к количеству этих клеток в пробе без аллергена. ЦФСК-тест (FLOW-CAST) был разработан Buhlmann laboratories. Его аналог BASOTEST разработан фирмой Beckton-Dickinson. ЦАСК-тест специфичен для определения IgE-опосредованной аллергии к ингаляционным аллергенам (кожные пробы нельзя проводить), пыльцевым (14), лекарствам, бета-лактамным антибиотикам (9), миорелаксантам (5), анальгетикам (5, 12), аллергии к латексу, укусам перепончатокрылых насекомых (7), псевдоаллергических реакций к противовоспалительным нестероидным препаратам (12), индуцированным компонентами комплемента, плазмой, опаределение аутоантител к IgE (15). Результаты ЦАСК-теста (FLOW-CAST) хорошо коррелируют с результатами кожных проб.
Клеточный тест высвобождения медиаторов (ЕК-CAST) основан на определении сульфолейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4), продуктов распада арахидоновой кислоты, трансформированного 5-липогеназой и глютатион-С-трансферазой после воздействии аллергенов на клетки.Сульфолейкотриены могут синтезироваться базофилами, тучными клетками, макрофагами, эозинофилами, почечными мезенгиальными клетками не только при IgE-опосредованных аллергических реакциях, но и при воспалительных процессах, лекарственной и пищевой непереносимости, псевдоаллергических реакциях. Синтезированный клетками LTC4 метаболизирует до образования LTD4 и LTE4.
Сульфолейкотриены могут определяться в различных биологических жидкостях методом ИФА. Тест считается положительным для пищевых, ингаляционных аллергенов, латекса, ядов насекомых при определении уровня лейкотриенов
³ 200пкг/мл; для лекарственных аллергенов, а также пищевых и химических добавок ³ 40пкг/мл.
Оба теста высоко специфичны для диагностики пищевой аллергии и непереносимости, ингаляционной аллергии, когда кожные тесты не могут быть использованы, аллергии на латекс, на ужаление перепончатокрылыми насекомыми, аллергии у детей, лекарственной аллергии и непереносимости, различных псевдоаллергических реакций.
Могут быть использованы одновременно оба теста (CAST-COMBI) для диагностики лекарственной аллергии, пищевой и лекарственной непереносимости, псевдоаллергических реакций, когда сульфолейкотриены определяют в надосадочной жидкости, а на базофилах – экспрессию CD63 АГ (13).
Применение ЦАСК-теста и клеточного теста высвобождения медиаторов в диагностике пищевой аллергии и непереносимости, псевдоаллергических реакций может быть использовано для составления гипоаллергенной и элиминационной диеты.
Таким образом, применение современных методов диагностики расширяет наши представления о патогенезе и возможностях лечения аллергических заболеваний.