Инъекции гидроксида алюминия приводят к двигательной недостаточности и дегенерации двигательных нейронов.

Кристофер А. Шоу и Майкл С. Петрик

Дополнительная информация о статье

Абстрактный

Синдром войны в Персидском заливе - это мультисистемное заболевание, от которого страдают многие ветераны западных армий во время войны в Персидском заливе 1990-1991 годов. У некоторых из них могут быть неврологические нарушения, включая различные когнитивные дисфункции и заболевание двигательных нейронов, последнее проявление практически неотличимо от классического бокового амиотрофического склероза (БАС), за исключением возраста начала. Этот «кластер» ALS представляет собой второй такой кластер ALS, описанный на сегодняшний день в литературе. Возможные причины GWS включают несколько адъювантов в вакцине против сибирской язвы и другие. Наиболее вероятным виновником является гидроксид алюминия. В первой серии экспериментов мы исследовали потенциальную токсичность гидроксида алюминия у самцов беспородных мышей CD-1, которым вводили подкожно в двух дозах, эквивалентных дозам, эквивалентным дозам для человека. После жертвы Образцы спинного мозга и моторной коры исследовали иммуногистохимическим методом. Мыши, получавшие алюминий, показали значительно повышенный апоптоз двигательных нейронов и увеличение количества реактивных астроцитов и пролиферации микроглии в спинном мозге и коре головного мозга. Окраска морином выявила присутствие алюминия в цитоплазме двигательных нейронов, при этом некоторые нейроны также дали положительный результат на наличие гиперфосфорилированного тау-белка, патологического признака различных неврологических заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и лобно-височную деменцию. Вторая серия экспериментов была проведена на мышах, которым вводили шесть доз гидроксида алюминия. Поведенческий анализ у этих мышей выявил значительные нарушения ряда двигательных функций, а также снижение объема пространственной памяти.

Ключевые слова: гидроксид алюминия, адъювант, нейротоксичность, синдром войны в Персидском заливе, боковой амиотрофический склероз.1. Введение

Различные исследования установили корреляцию между службой в войне в Персидском заливе (1990-1991) и мультисистемным расстройством, обычно называемым синдромом войны в Персидском заливе. В ТРУ различные неврологические расстройства, в том числе кажущейся кластер случаев амиотрофического склероза [ 1 - 4 ]. Хейли [ 3] описал классические симптомы БАС, такие как мышечная слабость и истощение, нарушение речи и глотания, затрудненное дыхание и фасцикуляция у ветеранов войны в Персидском заливе спустя годы после того, как у них впервые появились другие симптомы GWS. Семнадцать из 20 военнослужащих, у которых была диагностирована болезнь войны в Персидском заливе и определенный БАС, были моложе 45 лет, самый молодой из них - 20 лет. У всех 20 из этих пациентов были выявлены признаки дегенерации двигательных нейронов верхнего (моторная кора или бульбарная область) и нижнего (спинной мозг) двигательного нейрона. Ни у одного из этих пациентов не было семейного анамнеза БАС или других нейродегенеративных расстройств. Хорнер и др. [ 2] провел общенациональное тематическое исследование для определения уровней заболеваемости БАС в течение десятилетия после августа 1990 года среди военнослужащих, находящихся на действительной военной службе. Сто семь подтвержденных случаев БАС были выявлены у примерно 2,5 миллионов военнослужащих, имеющих право на получение помощи. При стандартизации к среднему населению США в 1990 году среднегодовая заболеваемость БАС среди неразвернутого военного населения составляла 1,4 случая на 100 000 человек в год по сравнению с общепринятой заболеваемостью населения 1,5 случая БАС на 100 000 человек. АЛС среди развернутого военнослужащего составила 3,6 на 100 000 человек в год. Weisskopf et al. [ 4 ] отметили общий рост заболеваемости БАС среди военнослужащих США на протяжении нескольких десятилетий, независимо от конфликта.

ALS - GWS - это один из двух кластеров болезней ALS, которые в настоящее время считаются удовлетворяющими определению кластера. Другой - гуамский вариант БАС, впервые описанный после Второй мировой войны, названный комплексом амиотропного бокового склероза, паркинсонизма и деменции (БАС - ПДК). Этот спектр расстройств, когда-то присутствующих, с уровнем заболеваемости в сотни раз выше, чем в континентальной части Соединенных Штатов [ 5] (обзор см. в Курляндии, 1988 г.), выраженный одним из двух способов. Первый был почти классической формой БАС; второй - форма паркинсонизма, связанная с деменцией, подобной болезни Альцгеймера (PDC). Приблизительно у 10% жертв развились оба расстройства, причем фенотип БАС обычно проявлялся первым. Исследования потенциальной этиологии были сосредоточены на факторах окружающей среды, при этом наибольшее внимание в конечном итоге было направлено на потребление токсинсодержащих семян местной разновидности саговниковой пальмы [ 6 ] и наличие высокого содержания алюминия в почве на юге Гуама [ 7 ].

Что касается вакцины GWS-ALS AVA, внимание в последнее время было обращено на адсорбированную вакцину против сибирской язвы (AVA) и различные ингредиенты вакцины, в частности известные и предполагаемые адъюванты, гидроксид алюминия и сквален [ 8 ]. Адъювант - это вещество, добавляемое во время производства вакцины, предназначенное для неспецифического усиления иммунного ответа на антиген [ 9 ]. Соединения алюминия были впервые идентифицированы как адъюванты более 90 лет назад. В настоящее время алюминий в различных формах (гидроксид алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия) является наиболее часто лицензируемым адъювантом, использование которого в целом рассматривается как фармацевтической промышленностью, так и различными государственными регулирующими органами как безопасное [ 10].]. Различные исследования не обнаружили никаких неблагоприятных или долгосрочных последствий для здоровья из - за алюминиевых адъювантов [ 11 - 13 ] , а также по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) продолжает свое давнее разрешение на использование алюминия в этой моде.

Несмотря на долгую историю широкого использования, физико-химические взаимодействия между соединениями алюминия и антигенами относительно плохо изучены, а лежащие в их основе механизмы остаются относительно неизученными [ 14 ]. Также кажется, что не было никаких строгих исследований на животных потенциальной токсичности алюминиевого адъюванта. Отсутствие таких исследований свойственно дано хорошо известное наблюдение , что алюминий в целом может быть нейротоксическое при ряде условий [ 15 , 16 ] и вспомогательных веществ , в частности , ранее были причастны к неврологического заболевания [ 17 - 19 ].Таблица 1показывает результаты предыдущих исследований, в которых животные лечили гидроксид алюминия, с перечислением его воздействия на нервную систему. Что касается использования алюминия в вакцинах, то, насколько нам известно, значения LD 50 для гидроксида алюминия на сегодняшний день не опубликованы (паспорта безопасности материалов JT Baker).

Таблица 1Резюме симптомов БАС и GWI у человека по сравнению с симптомами, наблюдаемыми у мышей и крыс, получавших алюминий. В этой таблице также показаны сходства между БАС у человека и болезнью, вызванной войной в Персидском заливе.

Потенциал для алюминиевых инъекций , чтобы вызвать макрофагальный миозит также был отмечен в литературе [ 20 - 22 ].

В предыдущей публикации рассматривалась потенциальная нейротоксичность нескольких известных или предполагаемых адъювантов вакцины [ 8 ]. В текущем исследовании мы сосредоточимся исключительно на влиянии инъекций гидроксида алюминия на моторное и когнитивное поведение и на проявление различных форм невропатологии в модели in vivo на мышах.

2. Экспериментальные процедуры.2.1. Экспериментальные животные

В нашем первоначальном исследовании [ 8 ] использовали молодых взрослых (3-месячных) мышей-самцов CD-1 (примерно 35 г в начале эксперимента). Более молодые животные были специально выбраны, чтобы имитировать типичный возраст службы во время войны в Персидском заливе [ 3 ]. Использовали четыре группы подкожных инъекций (две инъекции с интервалом в 2 недели): контрольный раствор физиологического раствора / фосфатного буфера (PBS) ( n = 10); гидроксид алюминия ( n = 11); сквален ( n = 10); и гидроксид алюминия и сквален ( н.= 10). В текущем исследовании будут представлены данные только об обработанных алюминием группах и контрольной группе из этой экспериментальной серии. Вторая серия экспериментов была проведена на 9-месячных самцах CD-1, которым вводили шесть инъекций гидроксида алюминия в течение 2-недельного периода. Этих мышей вместе с контрольными и другими экспериментальными группами (о которых будет сообщено в другом месте) были подвергнуты более строгому режиму поведенческого тестирования, который будет описан ниже. Гистологические исследования спинного мозга и мозга этих мышей продолжаются.

Все животные в обоих экспериментах содержались по одной клетке в Центре по уходу за животными Исследовательского центра Джека Белла в Ванкувере, Британская Колумбия, Канада. На протяжении всего эксперимента поддерживалась температура окружающей среды 22 ° C и световой цикл 12/12 ч. Всех мышей кормили кормом для мышей Purina® и давали доступ как к пище, так и к воде ad libitum .

Мышей из обоих исследований умерщвляли передозировкой галотана и транскардиально перфузировали 4% параформальдегидом (PFA). Ткани ЦНС собирали для гистологического исследования. Фиксированный мозг и спинной мозг всех мышей переносили в раствор 30% сахароза / PBS на ночь, а затем замораживали и хранили при -80 ° C до разделения. Все блоки ткани головного мозга / пуповины помещали в состав Tissue-Tek с оптимальной температурой резки (OCT) (Sakura, Zoeterwoude, Нидерланды), а затем с помощью криостата разрезали на коронковые срезы 30 мкм. Спинной мозг был разрезан на 25 мкм в поперечной плоскости. Срезы подвергали криозащите в 30% этиленгликоль - 20% глицерин - двухосновном и одноосновном растворах фосфата натрия и хранили замороженными при -20 ° C до использования.

2.2. Адъюванты

Alhydrogel ® , суспензия геля гидроксида алюминия (Al (OH) 3 ), использовалась в качестве источника гидроксида алюминия. Альгидрогель производится Superfos Biosector a / s (Дания) и приобретается у SIGMA Canada.

2.2.1. Дозы

Чтобы рассчитать приблизительные дозы гидроксида алюминия для людей в наших экспериментах, мы использовали следующую информацию: Вакцина AVA для использования человеком производится корпорацией Bioport из Лансинга, штат Мичиган. Согласно паспортам продуктов из Мичиганского института биологических продуктов (MBPI, Лансинг, Мичиган, США; предшественник Bioport), разовая доза вакцины AVA содержит 2,4 мг гидроксида алюминия (эквивалент 0,83 мг алюминия). Исходя из предполагаемой средней массы тела человека 70-80 кг, количество на 1 кг массы тела будет примерно 30-34 мкг / кг. Солдаты или гражданские лица, получившие вакцину, должны были получить от 30-34 мкг / кг (1 инъекция) до прибл. 200 мкг / кг при шести инъекциях.

Инъекции адъюванта обработанным мышам калибровали на основе средней массы животных для обоих экспериментов. В 3-месячном возрасте самцы мышей CD-1 весят прибл. 35 г; в 9 месяцев вес ок. 50 г. В эксперименте 1 мы выполнили две инъекции суспензии гидроксида алюминия (50 мкг / кг) в общем объеме 200 мкл стерильного PBS (0,9%) с интервалом в 2 недели. Следовательно, мыши в этом эксперименте получали бы 100 мкг / кг по сравнению с вероятными 68 мкг / кг у людей. В эксперименте 2 мыши получили шесть инъекций в общей сложности 300 мкг / кг гидроксида алюминия в течение 2 недель. Контрольным образцам в обоих исследованиях вводили 200 мкл PBS.

Место инъекции для введения человеку обычно подкожно над дельтовидной мышцей. Для инъекций мышам мы использовали подкожную инъекцию в дряблую кожу за шеей («загривок»), чтобы минимизировать дискомфорт и облегчить инъекцию.

2.3. Поведенческие тесты

В первом исследовании мышей регулярно подвергали определенным поведенческим тестам моторной и когнитивной функции, включая подвешивание проволочной сеткой (2 раза в неделю), открытое поле (1 раз в неделю) и водный лабиринт (1 раз в неделю). в течение 6 месяцев после инъекции (см. [ 22 ]). Порядок, в котором тестировали животных, был рандомизирован для каждого испытания. Во втором исследовании мы провели более подробное исследование поведения на основе автоматизированной системы EthoVision (Noldus Information Technology, Сиэтл, Вашингтон) с использованием видеокамеры и программного обеспечения для отслеживания (Noldus EthoVision ®).3.1). Индивидуальные перемещения мышей отслеживали в течение 5 мин в открытом поле с недельными интервалами. Программное обеспечение позволяло количественно измерять различные двигательные функции, включая пройденное расстояние, процент времени движения, скорость и многие другие. Эти последние эксперименты продолжались в течение 28 недель после последних инъекций.

2.4. Гистологические измерения (эксперимент 1)

2.4.1. NeuN и активная каспаза-3

Как указано в Petrik et al. [ 8 ], из каждой экспериментальной группы использовали по пять мышей. В каждом из них были исследованы несколько срезов головного ( n = 3) и спинного ( n = 8) головного мозга на разных уровнях. Уровни интенсивности флуоресценции NeuN и активированной каспазы-3 использовали для идентификации нейронов и клеток, умирающих в результате апоптоза, соответственно. Области интереса были определены с использованием ориентиров из стереотаксических атласов головного и спинного мозга мышей [ 23 , 24 ]. Все срезы подсчитывались беспристрастно под объективом 40 ×.

2.4.2. Холинацетилтрансфераза (ChAT) и глиальный фибриллярно-кислотный белок (GFAP)

Как указано в Petrik et al. [ 8 ], антитела к ChAT использовали для идентификации холинергических мотонейронов головного и спинного мозга [ 25 , 26 ]. GFAP использовался для мечения реактивных астроцитов [ 27 , 28 ].

2.4.3. Иба-1

Кроличьи поликлональные антитела против ионизированной молекулы адаптера связывания кальция (Iba-1) (Wako, Richmond, VA, USA) использовали для окрашивания активированной микроглии [ 29]. Для флуоресцентного иммуномодулирования Iba-1 при окрашивании использовался тот же протокол, что и для мечения GFAP, за исключением следующей модификации: срезы инкубировали с первичным кроличьим анит-Iba-1 (в PBST с 1% NGS + 1% BSA; разведение 1: 1000 ) в течение ночи при 4 ° C. Затем срезы инкубировали во вторичном антителе против кролика AlexaFluor 546 ™ в течение 2 часов при комнатной температуре (Molecular Probes; Eugene, OR, 1: 200).

2.4.4. Морин (3,5,7,2 ', 4'-пентагидроксифлавон, BDH)

Морин (M4008-2G, Sigma) представляет собой флуорохром, который при этом образует флуоресцентный комплекс с алюминием, флуоресцирующим зеленым (с длиной волны возбуждения 420 нм) [ 15 , 30 ]. Флуоресцентный анализ алюминия-морина использовали для визуализации и обнаружения алюминия в поясничном отделе спинного мозга и других тканях ЦНС в настоящих экспериментах. Краситель Морина использовали в виде 0,2% раствора в 85% этиловом спирте, содержащем 0,5% уксусной кислоты. Все смонтированные срезы сначала дважды промывали PBS в течение 5 мин. Затем срезы предварительно обрабатывали в течение 10 минут в 1% -ном водном растворе соляной кислоты, дважды промывали бидистиллированной водой (ddH 2O) в течение 5 минут и погружали в 0,2% раствор Морина на 10 минут. Затем срезы промывали ddH 2.O дважды в течение 5 мин, обезвоживают в 70%, 90% и 100% этиловом спирте (EtOH) и очищают 100% ксилолом. Затем все срезы были закреплены с использованием монтажной среды Vectashield (Vector Laboratories), запечатаны прозрачным лаком для ногтей и оставлены для высыхания на воздухе.

2.4.5. Окрашивание на гиперфосфорилированный тау-белок

Мечение гиперфосфорилированного тау (Anti-Human PHF-Tau, Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс) определяли с использованием нефлуоресцентного диаминобензидинового (DAB) метода. Предметные стекла, содержащие смонтированные срезы поясничного отдела спинного мозга, сначала дважды промывали PBS (2 × 5 мин) перед демаскированием антигена. Эндогенную пероксидазную активность гасили 0,3% перекисью водорода в метаноле в течение 20 мин. Срезы дважды промывали в PBS (2 × 5 мин) перед блокированием при комнатной температуре в течение 1 ч в блокирующем реагенте MOM (MOM Kit - пероксидаза, каталожный номер PK 2200, Vector Laboratoraties, Inc., Burlingame CA) с последующей быстрой промывкой. в PBS и 5 мин инкубации в растворе разбавителя MOM. Первичное антитело PHF-Tau разводили в 100 раз в растворе разбавителя MOM и проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 1 часа. После стадии инкубации первичных антител предметные стекла дважды промывали в PBS, а затем инкубировали в биотинилированном MOM реагенте против IgG мыши в течение 10 мин. Срезы промывали в PBS перед инкубацией с вторичным антителом (Vectastain ABC Elite Kit, каталожный номер PK-6101) в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией в реагентах Vectorstain ABC Elite в течение еще 30 минут. Предметные стекла снова ополаскивали в 1 × PBS. Развитие цвета было достигнуто с использованием раствора Vector ImmPACT ™ DAB (каталожный номер SK-4105). Когда желаемый цвет был достигнут, предметные стекла были промыты в ddH. каталожный № PK-6101) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией в реагентах Vectorstain ABC Elite в течение еще 30 мин. Предметные стекла снова ополаскивали в 1 × PBS. Развитие цвета было достигнуто с использованием раствора Vector ImmPACT ™ DAB (каталожный номер SK-4105). Когда желаемый цвет был достигнут, предметные стекла были промыты в ddH. каталожный № PK-6101) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией в реагентах Vectorstain ABC Elite в течение еще 30 мин. Предметные стекла снова ополаскивали в 1 × PBS. Развитие цвета было достигнуто с использованием раствора Vector ImmPACT ™ DAB (каталожный номер SK-4105). Когда желаемый цвет был достигнут, предметные стекла были промыты в ddH.2 O в течение 5 минут и контрастное окрашивание в 0,1% метиловом зеленом в течение 5 минут. После контр-окрашивания предметные стекла кратковременно промывали ddH 2 O, двумя сменами 95% этанола и двумя сменами 100% этанола. Срезы дают высохнуть , прежде чем они были установлены в предметном столике Permount ® (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ).

2.5. Микроскопия

Срезы головного и спинного мозга, обработанные флуоресцентными антителами или DAB, просматривали с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss Canada Limited, Торонто, Онтарио, Канада) при 40-кратном и 100-кратном (под маслом) увеличении. DAPI (синяя флуоресценция) просматривали с помощью абсорбционного / эмиссионного фильтра 359/461 нм. Alexa Fluor 546 ™ (красный) и кроличий IgG DuoLuX ™ (красный) просматривали с фильтром 556 557/572 573 нм. FITC просматривали с фильтром 490 494/520 525 нм. Срезы головного и поясничного отделов спинного мозга для гистологии были выбраны случайным образом для каждой группы. При подсчете с использованием увеличения 40 × было получено по два изображения на разрез спинного мозга: вентральный левый, вентральный правый. Изображения 40 × имели размер 350 × 275 мкм, а изображения 100 × имели размер 50 × 115 мкм. Изображения были получены с использованием программного обеспечения AxioVision 4.3.

2.6. Критерии определения и количественной оценки меченых клеток

Для количественной оценки подсчитывались только те клетки, которые находились в фокусе и полностью находились в поле зрения. Чтобы исключить вероятность того, что одна и та же клетка будет подсчитана дважды, срезы для каждого гистологического эксперимента были взяты только из одной лунки чашки для сбора, чтобы гарантировать, что срезы находятся на расстоянии не менее 250 мкм. Области, представляющие интерес для подсчета клеток, были определены с использованием ориентиров и контрольных точек из стереотаксических атласов спинного и головного мозга мышей [ 39 , 40]. В спинном мозге только клетки, которые были впереди центрального канала и глубокой вершины, где встречаются серое и белое вещество, считались частью вентральных рогов; Напротив, только клетки, расположенные кзади от центрального канала и задней глубокой вершины, считались частью дорсальных рогов. Эти критерии применялись независимо от исследуемых сегментов позвоночника. В головном мозге подсчитывались только клетки, обнаруженные в соответствующих структурах мозга. Все срезы подсчитывались беспристрастно (кодовый ключ был назначен животным для целей отслеживания, но не раскрыл идентичность лечения, которое было прописано животному).

2.7. Статистика

Значения для каждой мыши по отдельным задачам и в подсчете клеток использовались для расчета среднего ± SEM для каждой группы и условия. Поведенческие оценки и количество клеток нормализовали к среднему значению контроля. Средние значения сравнивали с использованием одно- или двухфакторного дисперсионного анализа (Statistica, Statsoft Inc., Талса, ОК; GraphPad Prism, Сан-Диего, Калифорния).

3. Результаты

В отличие от Petrik et al. [ 8 ], которое показало потерю ChAT-положительных мотонейронов в поясничном отделе мышей, получавших гидроксид алюминия, не было значительных различий в маркировке ChAT или количестве мотонейронов в шейном или грудном сегментах спинного мозга (Рис. 1A и B). Однако группа, получавшая инъекционный алюминий, показала очень значимое увеличение экспрессии GFAP-положительных астроцитов (70%), являющихся контрольной группой (указано как 100% для всех графиков;Рис. 1C) в шейном отделе спинного мозга. Эти результаты GFAP отражают результаты, ранее сообщенные для поясничного отдела спинного мозга.

рисунок 1Воздействие гидроксида алюминия на разные уровни спинного мозга (SC). (A и B) Мечение ChAT в шейном и грудном отделах, соответственно. (C и D) Нормализованное количество клеток для маркировки реактивных астроцитов GFAP в шейном и грудном отделах спинного мозга, ...

Мечение Iba-1 продемонстрировало значительно повышенные уровни активной микроглии в поясничном отделе спинного мозга животных, которым вводили алюминий (111%) по сравнению с контролем (Рис. 1E). Другие уровни спинного мозга в настоящем исследовании не тестировались на микроглию.

Только мыши, которым вводили гидроксид алюминия, показали значительно увеличенное морин-мечение клеток в поясничном отделе спинного мозга по сравнению с другими группами (Рис. 2A - E). Точно так же только мыши, которым вводили алюминий, показали наличие аномального тау-белка в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга (Рис. 3). Другие области пуповины не тестировались в текущих исследованиях ни на морин, ни на тау-белок.

Рис. 2Флуоресцентная маркировка морином в вентральном роге поясничного отдела спинного мозга мыши. Срезы от контрольных (A) мышей не показали флуоресцентного мечения Morin. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Морин-положительные мотонейроны у мышей, получавших гидроксид алюминия. (C и D) Высшее ...Рис. 3Иммуноокрашивание гиперфосфорилированного тау-белка в вентральном роге поясничного отдела спинного мозга мыши по сравнению с болезнью Альцгеймера. (A) Срез энторинальной коры человека от контрольного пациента. (B) Срез энторинальной коры человека пациента с болезнью Альцгеймера...

Множественные инъекции гидроксида алюминия в эксперименте 2 показали сильное влияние на моторное и другое поведение, как показано на Рис. 4 а также и 5.5. Множественные инъекции алюминия привели к значительным поведенческим результатам, включая изменения в поведении локомотива, (Рис. 4) и индуцированный дефицит памяти при выполнении задач в водном лабиринте (Рис. 5). Другие поведенческие показатели, включая мышечную силу и выносливость, измеренные путем подвешивания на тросе, и моторную координацию и баланс, измеренные с помощью вращающегося стержня, существенно не пострадали.

Рис. 4Анализ движения в открытом поле как оценка спонтанной активности и беспокойства у контрольных мышей по сравнению с мышами, которым шесть раз вводили гидроксид алюминия. Мыши, которым вводили гидроксид алюминия, показали следующие изменения в поведении: (A) Передвигались на более короткие расстояния ...Рис. 5Тест в водном лабиринте как оценка обучаемости и памяти. Мышам, которым вводили 6 × гидроксид алюминия, в среднем требовалось значительно больше времени для завершения лабиринта по сравнению с мышами, которым вводили физиологический раствор (двусторонний дисперсионный анализ ANOVA. * P = 0,0389).4. Обсуждение

Текущие результаты расширяют предварительные результаты, представленные Petrik et al. [ 8], показывая, что активация микроглии является частью основной патологии поясничного отдела спинного мозга. Эти данные добавляют к ранее сообщенным, т. Е. К потере моторных и других нейронов и активации реактивных астроцитов. В совокупности с текущими данными общая активация глиального воспалительного ответа в поясничном отделе спинного мозга позволяет предположить, что этот процесс является ключевой ранней стадией патологических событий, ведущих к гибели мотонейронов. Эта интерпретация подтверждается отсутствием потери двигательных нейронов и активации астроцитов на других уровнях спинного мозга, наблюдаемых в настоящем исследовании. При БАС и на животных моделях болезни активация глии с последующей гибелью двигательных нейронов часто, по-видимому, происходит последовательно вдоль брюшной нервной оси, при этом первые признаки патологии сначала появляются в поясничном отделе спинного мозга [31 ]. Учитывая это, представляется возможным, что исследование более поздних временных точек также покажет патологические реакции в грудном и шейном отделах спинного мозга. С другой стороны, алюминий, который, как было показано, присутствует в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга, возможно, не достиг этих других сегментов спинного мозга. В настоящее время ведутся исследования, которые позволят определить, имеют ли двигательные нейроны в этих других сегментах положительное окрашивание на алюминий.

Положительное окрашивание по Морину в поясничном отделе ясно демонстрирует, что алюминий после инъекции проникает в эту часть нервной системы. Одна из возможностей состоит в том, что это происходит за счет ретроградного транспорта от мышц к моторным нейронам в определенных сегментах. Это кажется маловероятным, учитывая, что наша парадигма подкожных инъекций не должна была быть нацелена на какой-либо конкретный сегмент спинного мозга. Другая возможность заключается в том, что алюминий может попасть в ЦНС системным образом, если он попадает в систему кровообращения. Текущие эксперименты предназначены для того, чтобы различить эти возможности.

Присутствие гиперфосфорилированного тау-белка, одного из отличительных признаков как болезни Альцгеймера, так и ALS-PDC Гуама, в мотонейронах в поясничном отделе спинного мозга ясно указывает на то, что происходят дополнительные патологические процессы, связанные с алюминием.

Поведенческие исходы во втором эксперименте, описанные здесь, подтверждают патологические исходы, наблюдаемые в первых исследованиях. Хотя гистологические измерения этих исследований еще не получены, степень поведенческого дефицита убедительно свидетельствует о том, что мы будем наблюдать широко распространенные нейрональные патологии. Большая степень поведенческих результатов в этом эксперименте может быть связана с экспериментальной парадигмой, которая утроила количество инъекций гидроксида алюминия.

В целом, результаты, представленные здесь, отражают предыдущую работу, которая ясно продемонстрировала, что алюминий, как в пероральной, так и в инъекционной формах, может быть нейротоксичным [ 15 , 16 , 32 , 33]. Потенциальные токсические механизмы действия алюминия могут включать усиление воспаления (например, микроглиоза) и нарушение холинергических проекций [ 34 ], снижение утилизации глюкозы [ 33 ], дефектные реакции фосфорилирования-дефосфорилирования [ 35 ], изменение скорости трансмембранной диффузии и селективность. изменения в насыщаемых транспортных системах гематоэнцефалического барьера (BBB [ 36] и окислительное повреждение клеточных процессов за счет ингибирования окислительно-восстановительного цикла глутатиона [ 37 ].

Учитывая вышесказанное, неудивительно, что алюминий был широко предложен в качестве фактора нейродегенеративных заболеваний и был обнаружен в ассоциации с дегенерирующими нейронами в определенных областях ЦНС [ 38 - 41 ]. В исследованиях на животных алюминий был связан с накоплением тау-белка и бета-амилоидного белка и, как было обнаружено, индуцирует апоптоз нейронов in vivo, а также in vitro 30 . У животных, которым вводили алюминий, наблюдается тяжелая антероградная дегенерация холинергических окончаний коры и гиппокампа [ 42 ].

Алюминий в его адъювантной форме может получить доступ к ЦНС [ 42 - 44 ], однако пероральное введение геля гидроксида алюминия, по-видимому, не является нейротоксичным для человека [ 45 ], в отличие от хлорида алюминия у крыс [ 46 ]. Путь воздействия и, возможно, форма алюминия могут быть важными факторами, определяющими потенциал токсичности.

Мы предполагаем, что наблюдаемые нейротоксические эффекты гидроксида алюминия в настоящем исследовании возникают как по «прямым», так и «непрямым» путям, некоторые из которых указаны выше. Прямая токсичность относится к физическому присутствию (или непосредственной близости) алюминия и его способности инициировать пути гибели клеток. Накопление алюминия в цитоплазме посредством клеточных механизмов поглощения или диффузии может вызывать изменения в глутаминазе и глутаминсинтетазе и легко изменять доступность нейротрансмиттера глутамата [ 47 ]. Алюминий, вызывающий аномальное накопление тау-белка, также может увеличивать нейрофибриллярные клубки и нарушать механизмы клеточного транспорта [ 48]. Вне клетки алюминий может воздействовать на нейроны, изменяя синапсы. Например, было показано, что алюминий уменьшает толщину постсинаптической плотности, увеличивает ширину синаптической щели и увеличивает количество плоских синапсов [ 49 ]. Алюминий также может блокировать активируемые напряжением кальциевые каналы [ 50 ], увеличивать активность ацетилхолинэстеразы [ 51 ] или мешать синаптической передаче, просто накапливая в синаптической щели [ 52 ]. Алюминий также может вызывать апоптоз в астроцитах [ 53]. Поскольку астроциты необходимы для поддержания здоровья нейронов, любая потеря функции астроцитов может оказаться токсичной для нейронов. Непрямая токсичность алюминия может проявляться по-разному, в том числе путем активации различных цитокинов [ 54 ], высвобождения глутамата в каскаде эксайтотоксических реакций или путем модификации различных ферментативных путей [ 55 ].

В дополнение к вышеуказанным действиям, специфическим для нервных клеток, алюминий может действовать косвенно, стимулируя аномальные, общие иммунные ответы. Фактически, это то, для чего в вакцинах вводятся адъюванты. Таким образом, адъювантная нейротоксичность может быть результатом несбалансированного иммунного ответа. Рук и Зумла [ 56 ] предположили, что множественные вакцинации, стресс и метод вакцинации могут привести к сдвигу иммунного ответа [ 56 , 57 ]. Ранее было показано, что гидроксид алюминия стимулирует ответ Th2-цитокинов [ 9 , 58 ].

В то время как текущие результаты и наше предыдущее исследование продемонстрировали значительные поведенческие и невропатологические исходы с гидроксидом алюминия и некоторые дополнительные значимые результаты, обусловленные комбинацией адъювантов, важно признать, что они были достигнуты при минимальных условиях.Таблица 1суммирует аспекты симптомов БАС и GWS у человека по сравнению с результатами, наблюдаемыми у мышей, которым вводили алюминий. Существует вероятность того, что возможен синергетический эффект между адъювантами и другими переменными, такими как стресс, множественные вакцинации и воздействие других токсинов. Недавнее исследование, в котором изучались некоторые из этих факторов в сочетании, показало, что стресс, вакцинация и пиридостигмина бромид (ингибитор карбамат-антихолинэстеразы (AchE)) могут синергетически воздействовать на множество стресс-активируемых киназ в головном мозге, вызывая неврологические нарушения в GWS [ 59 ]. . Кроме того, генетический фон в контексте воздействия алюминия может сыграть решающую роль и стать важной областью для будущих исследований.

Демонстрация невропатологических исходов и поведенческих нарушений у мышей, которым вводили гидроксид алюминия, может дать некоторое представление о причинах не только GWS-ALS, но может открыть возможности для исследования других неврологических заболеваний.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Канадского благотворительного фонда «Шотландский обряд» и Канадского совета естественных и технических исследований (CAS). Мы благодарим доктора Мерил Насс (больница Маунт-Дезерт-Айленд, штат Мэн, США) и подполковника Джона А. Ричардсона (USAFR, в отставке) за их неоценимые комментарии и консультативный вклад в этот проект и рукопись.

СокращенияchEАнтихолинэстеразаALS - PDCБоковой амиотрофический склероз-паркинсонизм, деменцияAVAАдсорбированная вакцина против сибирской язвыBSAБычий сывороточный альбуминGFAPГлиальный фибриллярный кислый белокЧатХолина ацетилтрансферазаGWSСиндром войны в Персидском заливеNGSнормальная козья сывороткаОктябрьОптимальная температура резкиPBSTФосфатный буферный раствор - Твин 20PFAПараформальдегидСноски

Одобрение этики животных: протоколы, регулирующие использование животных, были одобрены контрольными комитетами Университета Британской Колумбии и соответствовали руководящим принципам, опубликованным Канадским советом по уходу за животными, и находятся в соответствии с международными руководящими принципами, включая Руководство NIH по уходу. и Использование лабораторных животных, а также Директивы Совета ЕЭС.

Конфликт интересов: ни один из авторов не получил никаких грантов или финансирования от Bioport, Chiron, Corixa или каких-либо других фармацевтических компаний, упомянутых в этой статье.

51. Затта П., Ибн-Лхаят-Идрисси М., Замбенедетти П., Килиен М., Кисс Т. Мозг Res Bull. 2002; 59 : 41-45. [ PubMed ] [ Google Scholar ]52. Banin E, Meiri H. Brain Res. 1987; 423 : 359-363. [ PubMed ] [ Google Scholar ]53. Aremu DA, Meshitsuka S. Brain Res. 2005; 1031 : 284-296. [ PubMed ] [ Google Scholar ]54. Джонсон В.Дж., Шарма Р.П. Нейротоксичность. 2003; 24 : 261-268. [ PubMed] [ Google Scholar ]55. Nayak P, Chatterjee AK. Food Chem Toxicol. 2001; 39 : 1285-1289. [ PubMed ] [ Google Scholar ]56. Ладья Г.А., Зумла А. Ланцет. 1997; 349 : 1831-1833. [ PubMed ] [ Google Scholar ]57. Rook GA, Zumla A. Hosp Med. 1998; 59 : 10-11. [ PubMed ] [ Google Scholar ]58. Валенси Дж. П., Карлсон Дж. Р., Ван Нест Г. А.. J Immunol. 1994; 153 : 4029-4039. [ PubMed ] [ Google Scholar ]59. Ван Д., Перидес Г., Лю Ю. Ф. J Neurochem. 2005; 93 : 1010-1020. [ PubMed ] [ Google Scholar ]

Twins_love