Оплодотворение яйцеклеток in vitro и культивирование эмбрионов (эмбриологический этап ЭКО)
После пункции фолликулов фолликулярная жидкость, содержащая яйцеклетки, немедленно передается в эмбриологическую лабораторию, где ее исследует эмбриолог под микроскопом, отбирая яйцеклетки. Яйцеклетки окружены маленькими трофическими клетками кумулюса, которые питают яйцеклетку. Каждый такой комплекс яйцеклетки с кумулюсными клетками промывается в специальной среде, и затем оценивается зрелость яйцеклеток. Затем их помещают в специальную питательную среду и переносят в инкубатор, где они ожидают оплодотворения сперматозоидами.
Зрелая неоплодотворенная яйцеклетка, очищенная от клеток кумулюса.
Во время проведения пункции фолликулов у женщины, ее муж собирает сперму путём мастурбации в специальный нетоксичный стерильный контейнер. Некоторые мужчины испытывают большие трудности при сборе спермы в строго определенное время из-за огромного стресса и «обязательности исполнения». Об этом они должны предупредить врача заранее. Такие мужчины могут прибегнуть к предварительной криоконсервации (заморозке) спермы, которая затем может быть разморожена в день пункции фолликулов жены и использована в цикле ЭКО. Сперма также может быть собрана во время полового акта, но только в специальные стерильные нетоксичные для спермы презервативы, которые могут быть вам выданы в клинике. Существует большое количество факторов при сборе спермы, оказывающих заметное влияние на ее качество. Поэтому в нашей клинике разработана специальная инструкция для мужчин по подготовке и сбору спермы, с которой пациент знакомится заранее перед началом программы экстракорпорального оплодотворения.
После сбора спермы сперматозоиды отмываются от семенной жидкости по специальной технологии, которая позволяет отобрать наиболее подвижные и морфологически нормальные сперматозоиды. Определенное количество подвижных сперматозоидов (обычно 100000 сперматозоидов/мл) смешивают с яйцеклетками (эту процедуру называют «оплодотворением в пробирке» или инсеминацией in vitro, внимание – не путать с ) и помещают в инкубатор. Проникновение сперматозоида в яйцеклетку, как правило, происходит в течение несколько часов. Оплодотворение обычно проводят через 2-6 часов после пункции фолликулов.
В инкубаторе поддерживается постоянный уровень углекислого газа, температуры и влажности. Условия в инкубаторе и состав питательной среды имитируют условия в фаллопиевых трубах, создавая эмбриону максимально возможные благоприятные условия in vitro. Питательная среда имеет высокую степень очистки от тяжелых металлов и содержит такие ингредиенты, как белки, аминокислоты, пируват, соли, сахара, и специальный буфер кислотности, создающие оптимальные условия для роста и развития эмбриона – это для него своего рода «питательный бульон».
Когда по разным причинам ожидается низкий процент оплодотворения при стандартной процедуре ЭКО (например, при малом количестве подвижных сперматозоидов в эякуляте или низком проценте оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО), используются специальные микроманипуляционные методы. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ – транслитерация от английского сокращения ICSI) - наиболее часто используемый метод – это процедура, при которой единичный сперматозоид вводится непосредственно в яйцеклетку для ее оплодотворения. В США ИКСИ проводится примерно в половине всех циклов ВРТ. В клинике АльтраВита мы также весьма широко используем этот эффективный метод (подробнее о процедуре ИКСИ можно прочитать ).
Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ), при которой сперматозоид вводится непосредственно внутрь яйцеклетки для ее оплодотворения.
В целом, процент наступления беременности и процент родов после ИКСИ сопоставимы с результатами после традиционного ЭКО. Если у мужчины обнаружены наследственные патологии, являющиеся причиной бесплодия, которые могут быть переданы от отца к сыну, перед проведением ИКСИ рекомендуется медико-генетическое консультирование.
Через 18 часов после добавления сперматозоидов к яйцеклеткам или ИКСИ эмбриолог проверяет, сколько яйцеклеток нормально оплодотворились. Нормально оплодотворившаяся яйцеклетка (зигота) представляет собой в этот момент одну клетку с двумя пронуклеусами. Пронуклеусы похожи на маленькие прозрачные пузырьки внутри клетки, и один из них несет генетический материал отца, а второй - матери. Когда они сольются, образуется новая жизнь с уникальным генетическим набором. Яйцеклетки с аномальным оплодотворением (например, содержащие три пронуклеуса вместо двух), а также неоплодотворившиеся яйцеклетки в дальнейшем не используются.
Процент нормально оплодотворившихся яйцеклеток - это биологическая переменная, которую мы, к сожалению, все еще не можем полностью контролировать. В некоторых случаях, даже когда яйцеклетки и сперматозоиды выглядят абсолютно нормально, оплодотворение вообще не происходит. Однако, как правило, от 50% до 90% зрелых яйцеклеток нормально оплодотворяются после инсеминации in vitro или ИКСИ. Более низкий процент оплодотворения наблюдается в том случае, когда сперматозоид или яйцеклетка морфологически плохого качества, а полное отсутствие оплодотворения может быть связано с патологией оплодотворяющей способности сперматозоидов или с патологией яйцеклеток.
Нормально оплодотворившиеся яйцеклетки (зиготы) продолжают культивировать дальше; они начинают дробиться, и их качество оценивают еще через 24 часа. Эмбрионы оценивают на основании их внешнего вида и скорости дробления. Эмбрионы хорошего качества делятся довольно быстро: через два дня после оплодотворения нормальные эмбрионы имеют 2-4 клетки приблизительно равного размера с прозрачной цитоплазмой и отсутствием фрагментации клеток.
Оплодотворенная яйцеклетка, прошедшая один цикл дробления и образовавшая двухклеточный эмбрион. К третьему дню эмбрион содержит в среднем от 6 до 10 клеток. К пятому дню внутри эмбриона формируется полость с жидкостью, и клетки дифференцируются на два типа: те, из которых впоследствии сформируется плод, и те, из которых сформируется плацента. На этой стадии эмбрион называется бластоцистой. Эмбрионы могут быть перенесены в матку в любой момент с первого по шестой день после пункции. Если нормальное развитие продолжается и в матке, эмбрион «вылупляется» из окружающей его оболочки (зоны пеллюцида) и имплантируется в эндометрий матки приблизительно с 6 по 10 день после оплодотворения. 
«Идеальный» 8-клеточный эмбрион на третий день развития.Это эмбрион с одинаковыми бластомерами правильной сферической формы, без фрагментации. 
Бластоциста на пятый день развития. Бластоцель – это заполненная жидкостью полость;из внутренней клеточной массы впоследствии сформируется плод, а из трофектодермы – плацента.Перенос эмбрионов в полость матки
Перед переносом эмбрионов в полость матки мы показываем пациентам их эмбрионы на экране монитора, соединенном с видеокамерой микроскопа в эмбриологической лаборатории. Процедура переноса обычно безболезненна, так как она не требует расширения шейки матки, хотя некоторые женщины испытывают небольшие спазмы, и им может потребоваться успокоительное. С помощью обычного вагинального зеркала врач получает доступ к шейке матки. Катетер для переноса эмбрионов представляет собой длинную тонкую стерильную силиконовую трубку со шприцем на одном конце. Диаметр катетера – 1-2 мм. Катетер заполняется питательной средой, содержащей один или несколько эмбрионов. Врач мягко направляет кончик катетера через шейку матки в полость матки и шприцом выдавливает из катетера среду с эмбрионами. Как правило, перенос эмбрионов в выполняется под контролем УЗИ, и врач может видеть на мониторе, как среда с эмбрионами перемещается в полость матки.
Многочисленные зарубежные исследования показали, что нет необходимости находиться в горизонтальном положении после переноса эмбрионов дольше 10 минут, потому что это не влияет на наступление беременности. Если эмбрион попал в матку, он уже не может оттуда «выпасть». Однако если пациентка хочет провести в постели 1-2 часа после переноса эмбрионов, мы даем ей возможность оставаться в палате несколько часов.
Несмотря на кажущуюся простоту, перенос эмбрионов в полость матки является самым ответственным и критическим этапом цикла экстракорпорального оплодотворения. В литературе опубликованы данные, указывающие на то, что при переносе может теряться до 30% эмбрионов. Большое влияние на успех оказывает наличие и консистенция слизи шейки матки. Так, например, эмбрион может прилипнуть к катетеру внутри или снаружи, или может увлекаться вслед за выводящимся катетером в шейку матки. В клинике "АльтраВита" разработан специальный протокол переноса эмбрионов, позволяющий предотвратить подобные ситуации.
Перенос эмбрионов через шейку матки.
Обычно в матку переносят 1-3 эмбриона хорошего качества на 2-5 день после пункции. Эмбриологи разработали специальную шкалу для оценки качества эмбрионов. Такая шкала качества базируется на внешнем виде (морфологии) как эмбриона в целом, так и отдельных его клеток и внутриклеточных структур (ядра, ядрышки и др.). Но и это не позволяет сделать абсолютно точный прогноз. Очень часто после переноса в матку двух морфологически равноценных эмбрионов, наступает одноплодная беременность. Какой из эмбрионов дал начало этой беременности, и почему именно этот, а не другой (ведь переносили их на один и тот же эндометрий), все еще является загадкой. Сделать более точный прогноз позволяет проведение преимплантационной генетической диагностики, позволяющей выявить генетические нарушения у эмбрионов с абсолютно нормальной морфологией.
Иногда для переноса имеются только эмбрионы среднего или плохого качества. Шансы наступления беременности при переносе эмбрионов плохого качества снижаются, но если беременность наступит, ребенок будет абсолютно здоровым! Это связано с тем, что морфология эмбриона далеко не всегда является отражением его генотипа и потенциала к развитию. Кроме того, эмбрионы с теми или иными генетическими патологиями, как правило, не могут имплантироваться в матку, или же беременность прерывается на ранних сроках – в течение первого триместра беременности.
Вопрос о том, сколько эмбрионов переносить в матку, является одним из самых сложных вопросов, с которым сталкивается врач и пациент ЭКО. Чем больше перенесено эмбрионов, тем выше вероятность наступления беременности. Поскольку целью ЭКО является наступление беременности, почему, казалось бы, не перенести все имеющиеся эмбрионы? Однако ценой, которую приходится платить за перенос большого количества эмбрионов, является высокий риск многоплодной беременности, чреватой тяжелейшими осложнениями как для матери, так и для плода. Проблема осложняется также тем, что каждый эмбрион может разделиться на два эмбриона, что приведет к рождению так называемых однояйцевых близнецов.
В некоторых скандинавских странах закон запрещает переносить в матку женщины моложе 35 лет более одного эмбриона, чтобы снизить вероятность многоплодной беременности.
После ЭКО
Перенос эмбрионов является последним этапом в цикле ЭКО, и после него врач назначает препараты для «поддержки лютеиновой фазы», которые повышают вероятность имплантации и могут включать препараты эстрогенов, прогестерона или ХГЧ. Период после переноса эмбрионов является для пациентов, пожалуй, самой сложной частью программы ЭКО, из-за неизвестности и огромного напряжения в ожидании ответа на вопрос, наступила беременность или нет. Беременность определяется с помощью специального анализа, измеряющего содержание гормона ХГЧ в сыворотке крови спустя 10-14 дней после переноса. Этот гормон синтезируется только клетками эмбриона. Для многих пациентов эти 14 дней кажутся самыми длинными днями в их жизни!
После переноса эмбрионов не рекомендуется принимать горячие ванны, следует избегать тяжелой физической нагрузки и воздержаться от половых актов. Однако женщина может вести привычный образ жизни и при необходимости вернуться к работе на следующий день после переноса. Некоторые пациентки решают провести в постели две недели до теста на беременность, вставая только для приема пищи и похода в туалет. Вы можете это сделать, чтобы впоследствии знать, что вы предприняли все, что было в ваших силах, даже если беременность не наступила. Однако имейте в виду, что ваша нормальная физическая активность никак не повлияет на ваш шанс забеременеть.
