ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТРОМБОФИЛИИ СРЕДИ ЖЕНЩИН, ПРОХОДИВШИХ ПРОГРАММУ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

Центральная клиническая больница, г. Баку, Азербайджан

Актуальность. Известно, что беременность является фактором риска развития тромбозов [1, 2]. И этот риск в 10 раз возрастает по сравнению с той же возрастной группой женщин вне беременности [4]. На каждые 1000 родов приходится 2-5 случаев тромботических осложнений. До 50% венозных тромбозов возникают у женщин до 40 лет, и, как правило, все они связаны с беременностью [5, 6]. К тому же наличие тромбофилии сопряжено с повышенным риском развития осложнений беременности [3], такими как привычное невынашивание, плацентарная недостаточность, задержка развития плода, гестозы, включая преэклампсию и эклампсию, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты и т.д. Зачастую среди женщин, проходивших программу экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) по поводу бесплодия беременность не всегда заканчивалась к сроку беременности или вовсе не развивалась из-за возникновения, как одна из наиболее частых причин, тромбозов в фетоплацентарной системе мать-плацента-плод. Причиной же возникновения тромбозов являются генетически обусловленные дефекты гемостаза и приобретенные - антифосфолипидный синдром (АФС), который по характеру формирования тромбофилии может быть приравнен к генетически обусловленным дефектам гемостаза.

Цель исследования. Определение клинического значения выявления генетических форм тромбофилии и антифосфолипидных антител (АФА) среди женщин, забеременневших путем ЭКО с целью увеличения благоприятного завершения беременности.

Задачи исследования.

1. Выявить частоту встречаемости тромбофилии среди женщин репродуктивного возраста, забеременевших традиционным способом и путем ЭКО;

2. Провести сравнительную характеристику встречаемости тромбофилических мутаций на генетическом уровне;

3. Разработать алгоритм своевременного выявления и проведения коррекции тромбофилических мутаций среди женщин в программе ЭКО с целью повышения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) населения и благополучного завершения беременности.

Материалы и методы. Работа проводилась на базе данных Центральной Клиники (Мərkəzi Klinika) г.Баку. Всего было обследовано 150 женщин в возрасте от 19 до 44 лет. Были выделены 2 исследовательские группы: 1 группа - 50 женщин репродуктивного возраста, забеременевших традиционным способом, 2 группа (100 женщин) - путем ЭКО. У всех пациенток 2-й группы в анамнезе имело место акушерско-гинекологическая патология: внематочная беременность, синдром потери плода - преэмбрионические потери, ранние выкидыши в анамнезе (1 выкидыш и более, неразвивающаяся беременность до 12 недель), поздние выкидыши, а также неудачные попытки инсеменации и ЭКО. Клиническое обследование включало детальное изучение соматического анамнеза, акушерско-гинекологического анамнеза (характер становления и нарушения менструальной функции, репродуктивная функция), семейного и тромботического анамнеза. Из 2 группы были исключены женщины с хромосомными аберрациями, анатомическими дефектами и выраженными эндокринными нарушениями. Все женщины были обследованы на наличие тромбофилии с момента взятия на учет, путем иммуноферментного анализа (ИФА) определения циркуляции в сыворотки крови антител к кардиолипину (АКА), волчаночного антикоагулянта (ВА), а также на наличие генетических мутаций в системе тромбогенеза, путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) на мутацию Protromin (F II) - G 20210A, MTHFR - C 677 T, FV Leiden, MTRR IIe 22 Met 66 A-G, полиморфизм гена 675 4G/5G PAI-1. Принципы диагностики АФС были представлены в следующем виде. При выявлении ВА как наиболее информативного серологического агента даже однократно и наличии клинических проявлений выставлялся диагноз АФС. При обнаружении высоко-, средне- или низкопозитивных титров АКА без ВА и наличии клинических проявлений требовалось повторное обследование с промежутком времени в 2-3 мес., в случае повторного положительного результата диагноз подтверждался. При отрицательных серологических тестах на наличие основных маркеров АФС и клиники тромбофилических состояний проводились исследования на вспомогательные морфологические субстраты дважды с промежутком в 2-3 мес., и лишь при обнаружении последних выставлялся диагноз сомнительного АФС. Статистическая обработка данных проводилась с помощью прикладного пакета Microsoft Excel. Результаты исследований. Из 100 женщин 67% страдали первичным бесплодием, 33% - вторичным. Длительность бесплодия составляла в среднем 8,2±5,0 лет. Возраст колебался от 19 до 44 лет. 9% женщин в анамнезе имели внутриматочные вмешательства, выскабливание полости матки после самопроизвольных выкидышей, диагностическое выскабливание полости матки - 35%, 39% имели беременности в анамнезе, у 9% было прерывание беременности в различные сроки, у 16% - «замершая» беременность. 17% женщинам проводилась длительная стимуляция овуляции, 96% - внутриматочная инсеменация. По данным многочисленных исследований тромбофилия в 75% является причиной акушерских осложнений, таких как синдром потери плода, привычное невынашивание беременности, задержка внутриутробного развития (ЗВУР), гипоксия плода, антенатальная гибель плода, гестоз, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, тромбозы и тромбоэмболии, ДВС-синдром, трофобластическая болезнь, сенсибилизация к хрионическому гонадотропину человека, HEELP-синдром, неудачные попытки ЭКО и инсеменации. Таким образом, базируясь на данных соматического, акушерско-гинекологического, семейного и тромботического анамнеза нами были выявлены следующие виды акушерских осложнений (табл. 1).

Таблица 1. Частота встречаемости акушерских осложнений среди женщин репродуктивного возраста, забеременневших традиционным способом и путем ЭКО.

Кроме того, нами было выявлено, что частота встречаемости тромбофилических мутации среди женщин репродуктивного возраста превалирует в 3,7 раз во 2 группе по сравнению с контрольной группой. Частота встречаемости АФА в сыворотке крови также превалировало во 2 группе в 6,75 раз чаще по сравнению с 1 группой. Так диагностика встречаемости тромбофилии путем использования метода ИФА на наличие в сыворотке крови АФА составила 8% в контроле, нежели путем ПЦР - 26%. У многих обследуемых женщин диагностически значимым было обнуружение наличия нарушения в системе гемостаза путем использования метода ПЦР, в то время как использование метода ИФА на наличие циркуляции в крови АФА было не информативным. То есть многие женщины в таком случае просто остаются без должного внимания особенного ведения беременности. Таким образом, наилучшим и наиболее доставерным методом диагностики наличия тромбофилии является метод ПЦР, то есть определение наличия тромбофилии на генетическом уровне (табл. 2).

Таблица 2. Частота встречаемости тромбофилии среди женщин, забеременневших традиционным способом и путем ЭКО.

Осложнения тромбофилий в акушерской практике связано с тем, что при этом нарушается сбалансированное равновесие соотношения антикоагулянтных и прокоагулянтных механизмов в пользу последних. При этом снижается глубина инвазии трофобласта, и имплантация становится неполноценной. Это является причиной бесплодия и ранних предэмбриональных потерь, а нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока вследствие развития тромбозов сосудов является патогенетической причиной таких осложнений, как бесплодие неясного генеза, синдром привычного невынашивания беременности, отслойка нормально расположенной плаценты, преэклампсия, ЗВУР, синдром потери плода (неразвившаяся беременность, мертворождаемость, неонатальная смертность как осложнение преждевременных родов, тяжелого гестоза, плацентарной недостаточности), HELLP-синдром, неудачные попытки ЭКО. В настоящее время стало возможным объяснение ранее необъяснимых таких случаев тромботических осложнений в связи с открытием ряда ранее неизвестных обусловленных дефектов гемостаза, предрасполагающих к тромбозу, имеющие высокое прогностическое значение, таких как: мутация метилентетрагидрофолатредуктазы, лейденская мутация гена V фактора свертывания крови, мутация гена протромбина G20210A. Нами было выявлено (табл. 3), что среди генетических форм тромбофилии наиболее широко распространненой формой среди женщин, забеременневших путем ЭКО, является полиморфизм гена ингибитора активаторов плазминогена-1 (PAI-1), что составило 83,7%. Данный ген кодирует белок ингибитор активатора плазминогена, который играет важнейшую роль в регуляции фибринолиза, а также является неотъемлемым компонентом в процессе имплантации плодного яйца. Повышение концентрации PAI-1 в крови ведет к уменьшению активности противосвертывающей системы, что приводит к нарушению функции плаценты во время беременности и невынашивания плода. Так, Dawson и сотр. и Eriksson и сотрудники обнаружили, что данный вид мутации приводит к остановке развития беременности на малых сроках, тяжелые гестозы, внутриутробная смерть плода, гипотрофия и задержка внутриутробного развития, хроническая внутриутробная гипоксия плода, преждевременное созревание плаценты. Кроме того, исследование полиморфизма гена PAI-1 важно проводить и при подготовке к ЭКО, поскольку мощная гормональная терапия и огромные цифры эстрогенов, сопровождающие схемы ЭКО являются фактором, повышающих риск тромбозов в месте имплантации и ранней плацентации. Таким образом, своевременное назначение специальной профилактики во время беременности (низкодозированная ацетилсалицилловая кислота и малые дозы препаратов гепарина) позволило практически полностью устранить риск осложнений беременности у женщин с генотипом 5G/4G. На втором месте по встречаемости тромбофилии среди женщин, входивших в программу ЭКО, пришлось на мутацию редуктазы метионинсинтазы- MTRR IIe 22 Met 66 A-G, что составило 83,7%. Данный ген MTRR входит в состав «генов фолатного цикла»: метилентетрагидрофолат-редуктаза (метионинсинтаза-редуктаза (MTRR), метионин-синтаза (MTR)). Полиморфизмы в этих генах вместе с генами факторов свертываемости крови F2 и F5 вносят больший вклад в риск развития тромбофилий. В настоящее время известно, что полиморфизм 66A-G в гене MTRR, ведущий к замене интерлейцина на метионин в 22 положении белка, связан с атеросклерозом, тромбозом, не расхождением хромосом, повышенным риском образования дефекта нервной трубки у плода.

Таблица 3. Сравнительная характеристика встречаемости генетических форм тромбофилии среди женщин, забеременевших путем ЭКО.

У всех пациенток отмечалось нарушение в системе гемостаза по нескольким мутациям генов одновременно, что указывает на сложность и актуальность вопроса в акушерской патологии. 30,2% генетических тромбофилии составила мутация гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы), наиболее изученной ее вариант является - С677Т, в котором нуклеотид цитозина (С) в позиции 677, относящейся к 4-му экзону, заменен на тимидин (Т), что приводит к замене аминокислотного остатка алантина на остаток валина в сайте связывания фолата, проявляющийся повышением уровня гомоцистеина в крови. Общеизвестно, что высокие концентрации последнего ведут к риску развития нефропатии среди беременных. Кроме того, концентрация гомоцистеина в крови коррелирует с концентрацией фибронектина в клетках, что указывает на важную роль гомоцистеина в развитии эндотелиальной дисфункции при беременности. Повышение частоты аллеля 677T было отмечено не только при позднем гестозе, но и при других осложнениях беременности, таких как отслойка плаценты, задержка роста плода, антенатальная гибель плода. Сочетание аллеля 677T с другими факторами риска приводит к повышению риска раннего выкидыша. Общеизвестно, что мутация гена MTHFR, V фактора и протромбина являются одной из важных причин невынашивания беременности и фетоплацентарной недостаточности. Добавление же фолиевой кислоты, как базовая терапия ведения беременных с данной генетической тромбофилией, значительно снижает риск развития осложнений беременности. Рассматривая Лейденскую мутацию гена V фактора свертывания крови, что составило 22,6%, характеризуется заменой нуклеотида гуанина на нуклеотид аденин в позиции 1691. Это приводит к замене аминокислоты аргинина на аминокислоту глутамин в позиции 506 в белковой цепи, являющейся продуктом этого гена. Наличие данной мутации повышает вероятность развития целого ряда осложнений беременности, таких как невынашивания беременности на ранних сроках (риск повышается в 3 раза), отставания развития плода, позднего токсикоза, фетоплацентарной недостаточности. Кроме того недавнее исследование показало, что у носителей лейденской мутации частота успеха подсадок зародышей при ЭКО примерно в 2 раза выше, чем среди пациенток, не являющихся носителями данной мутации. Эти любопытные данные указывают на то, что, несмотря на повышенную вероятность развития осложнений, фертильность пациенток с лейденской мутацией может быть выше. Эффективное тромбирование сосудов в месте имплантации может быть важным условием успеха самых первых этапов взаимодействия зародыша со слизистой оболочкой матки. Кстати, именно поэтому избыточная гипокоагуляция не рекомендуется в дни подсадки зародышей и в предполагаемые дни имплантации при лечении нарушений репродуктивной функции, связанных с тромбофилией. Мутация гена протромбина G20210A (27,9%) характеризуется заменой нуклеотида гуанина на нуклеотид аденин в позиции 20210. При наличии данной мутации обнаруживаются повышенные количества химически нормального протромбина. Уровень протромбина может быть в полтора-два раза выше, чем в норме. Мутация наследуется по аутосомно-доминантному типу. Данная мутация является фактором риска всех осложнений, связанных с лейденской мутацией - невынашивание беременности, фетоплацентарной недостаточностью, внутриутробной гибелью плода, ЗВУР, отслойкой плаценты.

Выводы. Тромбофилические состояния (АФС, гипергомоцистеинемия, мутации генов MTHFR, V фактора и протромбина) являются одной из важных причин невынашивания беременности и фето-плацентарной недостаточности. Проведенное нами исследование показало необходимость выявления тромбофилических мутаций среди женщин забеременевших обычным способом и женщин проходивших программу ЭКО с целью повышения ВРТ, наступления и благополучного завершения беременности. Так, учитывая тип генетической мутации мы использовали соответствующие выработанные нами схемы лечения и ведения данных беременных, что в свою очередь позволило благополучно завершить беременность путем кесарево сечения 92% женщин. То есть точное определение генетических маркеров может отражать подверженность предполагаемому фактору риска в течение всей жизни пациента лучше, чем соответствующие анализы плазмы, результаты которых могут изменяться со временем. Мы полагаем, что внедрение этой и аналогичных тест-систем в клиническую практику для выявления наследственных тромбофилий будет способствовать осуществлению быстрой и эффективной диагностики, а также оптимальному подбору терапии. А применение своевременного и этиопатологического принципа лечения беременных, страдающих тромбофилией, приведет к повышенным результатам благоприятного завершения ЭКО. Профилактика и лечение наследственных тромбофилий не являются чем-то особенным и могут успешно осуществляться имеющимися на вооружении клиницистов гепарином и оральными антикоагулянтами. В связи с этим основной проблемой этой части современной медицины являются выявление маркеров тромбофилий и отработка режимов противотромботической терапии.

1. Тромбофилии и противотромботическая терапия в акушерской практике/ А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе. - М.: Триада-Х, 2003. - 465 c.

2. Озолиня Л.А. Прогнозирование и профилактика тромбозов и тромбоэмболий в акушерстве и гинекологии: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. - М., 1999. - 20 c.

3. Осложненное течение беременности и гипергомоцистеинемия/ Г.М. Савельева, В.С. Ефимов, А.З. Кашежева// Акушерство и гинекология. - 2000. - № 3. - С. 3-5.

4. Eldor A. Thrombophilia, thrombosis and pregnancy// Thromb. Haemost. - 2001. - Vol. 86. - P. 104-111.

5. An ultrasound study of gestational and postural changes in the deep venous system of the leg in pregnancy/ N.S. Macklon, I.A. Greer, A.W. Bowman// Br. J. Obstetr. Gynaecol. - 1997. - Vol. 104. - P. 191-197.

6. Mortinelli I. Risk factors in venous thromboembolism// Thromb. Haemost. - 2001. - Vol. 86. - P. 395-403.

В журнале «Врач-аспирант»:

7. Ходжимуратова Г.А., Султанов С.Н. Генетические факторы тромбофилии и их значение при преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты// Врач-аспирант, №6(55), 2012. - С.107-112