Лабораторные методы выявления аллергии

Точный диагноз аллергии ставится только после комплексного обследования. Оно включает сбор анамнеза, а также результаты специфического аллергологического освидетельствования — кожных проб (после 3-х лет) и исследования сыворотки крови на содержание специфических иммуноглобулинов Е и G. Ловушки для аллергенов XXI столетие, согласно прогнозам ВОЗ, станет веком аллергии. По данным организации, заболеванием страдает пятая часть жителей планеты. Оно выявляется у каждого шестого американца и каждого четвертого немца. В России, в зависимости от региона, аллергиков 5–30%, Украине — 20–30%. А в Беларуси лишь 2–5%. Такая малая доля связана с недостаточной выявляемостью: как правило, люди с симптомами этой болезни годами не обращаются к специалисту, зачастую не связывают некоторые формы с аллергической природой (например, лечат насморк как простудный). Проявляться недуг может в виде бронхиальной астмы, конъюнктивита, поллиноза, дерматита, отека, крапивницы, холодовой аллергии...

Антонина МАРКОВА, научный сотрудник клинической лаборатории профпатологии РНПЦ гигиены На основании лабораторных методов выявляется причина заболевания и ставится диагноз, затем решается вопрос о применении лекарств или небулайзерной терапии и ингаляторов, дающих длительный контроль над астмой и восстанавливающих систему дыхания. Одновременно нужно максимально ограничить контакт с аллергеном. Назначается гипоаллергенная диета. Точный диагноз ставится только после комплексного обследования. Оно включает сбор анамнеза, а также результаты специфического аллергологического освидетельствования — кожных проб и исследования сыворотки крови на содержание специфических иммуноглобулинов Е и G. Кожные пробы (прик-тестирование, скарификационный, аппликационный и внутрикожные тесты) показаны для диагностики IgЕ-зависимых аллергических заболеваний и позволяют определить антигены, имеющие значение в развитии симптомов у конкретного пациента. Лабораторные методы расширяют возможности кожных проб. Определение общих и антигенспецифических антител иммуноглобулинов E позволяет обследовать больного в период обострения, когда он получает антигистаминные и кортикостероидные препараты, имеет высыпания на коже; у беременных с неспецифической кожной чувствительностью и т. д. В норме в крови здоровых людей содержится незначительное количество общего иммуноглобулина Е (20–120 Ед/мл). Показатель у страдающих аллергией значительно повышен. Это неспецифический маркер заболевания, который отражает степень общей аллерголизации организма. Определение антигенспецифических антител иммуноглобулинов Е позволяет выявить конкретные аллергены, на которые реагирует организм. Исследование иммуноглобулинов Е (общих и специфических антител) проводится на основе иммуноферментного (ИФА) или хемилюминесцентного анализа (MAST-теста). Метод очень чувствительный, а полученная информация схожа с результатами кожного тестирования. Количество аллергенов, к которым можно определить индивидуальную непереносимость, постоянно расширяется (в настоящее время насчитывается около 500 наименований). Псевдоаллергические реакции близки по клинической симптоматике с истинными IgE-зависимыми реакциями, но отличаются отсутствием первой иммунологической стадии, т. е. при них происходит высвобождение медиаторов: гистамина, лейкотриенов, простагландинов — и нет образования антител. Для диагностики предложены цитометрический аллергенстимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест), тест торможения миграции лейкоцитов (ТТМЛ), клеточный тест высвобождения медиаторов (ЕК-CAST). ЕК-CAST основан на определении сульфолейкотриенов — продуктов распада арахидоновой кислоты, которые могут синтезироваться базофилами, тучными клетками, макрофагами, эозинофилами не только при IgE-зависимых аллергических реакциях, но и при воспалительных процессах, лекарственной и пищевой непереносимости, псевдоаллергических реакциях. Сульфолейкотриены выявляются в биологических жидкостях методом ИФА. Тест считается положительным для пищевых, ингаляционных аллергенов, латекса, ядов насекомых при определении уровня лейкотриенов ≥200 пкг/мл; для лекарственных аллергенов, а также пищевых и химических добавок ≥40 пкг/мл. Данные методы очень чувствительны и высокоспецифичны. При пищевой и лекарственной непереносимости, в отличие от истинной иммуноглобулин-Е-зависимой аллергии, большое значение уделяется исследованию иммуноглобулинов-G-зависимых реакций (II и III типы реакции гиперчувствительности). Важную роль в формировании непереносимости к молоку, яйцам, рыбе играют иммуноглобулин-G4-антитела. Этому способствуют заболевания желудочно-кишечного тракта: гастрит, хронические холецистит и панкреатит, колит, дисбактериоз кишечника. Для диагностики используется метод ИФА. К наиболее информативным исследованиям при пищевой аллергии относятся также радиоаллергосорбентный тест (РАСТ) с использованием САР-system, MAST-CLA-system и др. Если после обследования диагноз остается неясным, врач может назначить провокационные тесты. Их проводят в аллергологических стационарах по строгим показаниям из-за вероятности тяжелых системных реакций (анафилактический шок и т. д.). Когда контакт с аллергеном постоянный, то для подтверждения клинических проявлений заболевания используют элиминационные тесты. Типичный пример — диета, при которой из рациона полностью выводится предполагаемый аллергенный продукт. Для диагностики патологии и коррекции лечения врач может попросить пациента вести специальный дневник, в котором отмечается время начала аллергии, ее проявление и возможная причина. Это позволит назначить профилактическое лечение или исключить контакт с аллергеном. ЦАСК-тест и ЕК-CAST при пищевой аллергии и непереносимости, а также псевдоаллергических реакциях могут применяться для составления гипоаллергенной и элиминационной диеты. На основании лабораторных методов выявляется причина заболевания и ставится диагноз, затем решается вопрос о применении лекарств или небулайзерной терапии и ингаляторов, дающих длительный контроль над астмой и восстанавливающих систему дыхания. Одновременно нужно максимально ограничить контакт с аллергеном. Для этого применяются воздухоочистители, средства борьбы с микроклещами. Подушки, одеяла, матрасы желательно заменить на синтетические, использовать специальные наматрасники, наволочки и пододеяльники, предотвращающие контакт с микроклещами. Назначается гипоаллергенная диета.

Возможности профилактики аллергических заболеваний изучаются более 10 лет, однако, во всем мире наблюдается рост аллергических заболеваний, а заболеваемость аллергическим ринитом приобретает эпидемические пропорции (3, 6, 8). Отечественная школа аллергологов, созданная А.Д.Адо, всегда уделяла и уделяет большое внимание профилактике и диагностике аллергических заболеваний (3).

Профилактические и диагностические мероприятия включают:

1. сбор анамнеза;

2. лабораторная диагностика аллергических заболеваний: скарификационные, prick- и контактные кожные тесты, внутрикожные тесты, определение общего и специфических IgE, цитометрический аллерген стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест), клеточный тест высвобождения медиаторов, ТТЕЭЛ – тест торможения эмиграции лейкоцитов, тест дозированной физической нагрузки для диагностики крапивницы физического напряжения);

3. цитологическое и бактериологическое исследование мазков из носа и зева;

3. диспансерное наблюдение в медицинском учреждении, включая наличие медицинской карты или истории болезни, паспорта больного аллергическим заболеванием;

4. элиминация аллергенов:

а) воздухочистители, специальные пылесосы;

б) средства борьбы с микроклещами (акаросан, акарил, акарекс–тест)

в) замена подушек, одеял, матрасов на синтетические, специальные наматрасники, наволочки, пододеяльники, предотвращающие контакт с микроклещами;

г) изменение места жительства на период воздействия аллергенов (пыльцевые аллергены);

д) гипоаллергенная диета

В настоящее время создана целая индустрия, занимающаяся проблемами элиминации аллергенов. Перечисленные мероприятия позволяют поставить диагноз аллергического заболевания уже на ранних этапах, что способствует профилактике и эффективному лечению данной патологии.

Остановимся более подробно на современных методах диагностики аллергических заболеваний. По данным разных авторов в различных странах аллергическими заболеваниями страдают 10-30% населения (3). По данным ГНЦ – Института иммунологии, г.Москва, около 40 000 больных в год амбулаторно обращаются по поводу аллергических заболеваний. В последние годы наблюдается рост заболеваемости поллинозами, аллергическим ринитом.

В 1967г. Johansson S. и Bennich H. был открыт и описан IgE, что привело к созданию тест-систем, позволяющих определить общий и аллерген-специфические IgE. Данный тест не уменьшает значимости скарификационных и prick-кожных тестов, они применяются для определения причинно значимых аллергенов перед проведением аллерген специфической иммунотерапии (АСИТ). У определенных больных проведение кожных тестов затруднительно (аллергодерматозы; пациенты, получающие антигистаминные или кортикостероидные препараты; дети, с низким порогом кожной чувствительности; беременные с неспецифической кожной чувствительностью). Аллергические реакции, в механизме развития которых задействован IgE, получили название «истинных» или IgE-опосредованных.

В настоящее время на рынке имеется большой выбор тест-систем различного производства для определения аллерген специфических и общего IgE количественным или полуколичественным методом на основе ИФА или хемилюминесцентного MAST-теста. Количественный метод хорошо отработан для определения общего IgE. При полуколичественном методе аллерген специфические IgE оцениваются по классам в зависимости от интенсивности реакции (1 класс –низкая интенсивность; 2 класс – средняя; 3-высокая; 4 класс – очень высокая). Интенсивность реакции 1 класса не учитывается, как положительный результат.

MAST-тест (фирма «Люминери»), по мнению многих исследователей, более специфичен, позволяет быстрее получить результаты исследования, можно определять параметры даже у 1 больного, не ожидая набора проб. Одним из примеров количественного метода являются тест-системы фирмы «Биохиммак», когда с помощью построения калибровочной кривой можно определить количественные параметры аллерген специфических IgE.

Результаты кожных проб не всегда совпадают с результатами определения специфических IgE, что связывают с более сложными механизмами формирования кожной реакции. Параллельные исследования результатов кожных проб и MАSТ-теста показывают довольно высокую корреляцию

по данным Горячкиной Л.А., Демборинской А.С., см. табл. 1 (2).

Табл. 1. Корреляция результатов кожных проб и MAST-теста.

Аллергены

Положительные результаты кожных проб

Положительные результаты MAST-теста

% положительных результатов MAST-теста к результатам кожных проб

Шерсть животных

22

20

90,9%

Клещ Dermatho-phagoides

18

16

88,8%

Грибы

7

4

57,14%

Пыльца деревьев

16

15

93,7%

Пыльца злаковых трав

13

13

100%

Пыльца сорных трав

11

10

90,9%

Пищевые

12

7

58,3%

Из данных таблицы видно, что несоответствие результатов кожных проб и MAST-теста касается грибковых и пищевых аллергенов.

По данным Лусс Л.В. ложноположительные результаты при применении MAST-теста отмечались в 6,4% случаев, что может быть связано с перекрестно реагирующими аллергенами (4).

Особого внимания заслуживают контактные кожные тесты, стандартизированные международной группой авторов в 1967г. (11). Контактный дерматит относится к реакциям гиперчувствительности IV типа (гиперчувствительность замедленного типа) и в своем развитии проходит фазу индукции (сенсибилизации) и клинических проявлений. Роль аллергенов здесь могут выполнять низкомолекулярные белки, соли металлов, гаптены, лекарства. Сенсибилизированные Th1 (CD4+-клетки) вырабатывают гамма-интерферон (ИФН), что приводит к активации кератиноцитов, экспрессии HLA-DR, ICAM-1 АГ, выработке ИЛ-2 и других провоспалительных цитокинов, вазодилятации и развитию местного воспаления. При контактных кожных пробах химические соединения (аллергены, сульфат никеля, неомицин, формальдегид и т.д.) инкорпорированы на пластинках из геля (поливинилпирролидон, гидрооксипропилцеллюлоза), которые закрепляются на спине больного. Стандартная пластинка содержит 24 аллергена (фирма «Фармация»), действующая доза измеряется в мкг/см2. Разработаны специальные стрипы для контакта с жидкими аллергенами, растворенными в петриоляте или масле, воде и т.д. Например, при аллергическом дерматите результат (размер бляшки в месте контакта) стрипы снимают и измеряют результат через 48 часов контакта (- реакции нет; ± - только эритема; + - эритема и инфильтрация; ++ - эритема и не более 3-х папул; +++ - эритема и более 4-х папул; ++++ - эритема и большое количество выраженных папул; +++++ - эритема, пузырьки). Тест используется для диагностики у взрослых и детей. Время чтения результатов может варьировать от 48 часов до 7 дней (поздняя реакция). Истинная аллергическая реакция формируется через 72-96 часов (11).

В России были разработаны аппликационные и капельные пробы, когда на предварительно обработанную 70% спиртом кожу предплечья наносят каплю аллергена или кусочек марли, обработанной аллергеном (3).

Большое внимание уделяется диагностике IgG-опосредованных аллергических реакций (II и III тип реакции гиперчувствительности), часто в литературе обозначаемых термином пищевой или лекарственной непереносимости, в отличие от истинной IgE-опосредованной пищевой и лекарственной аллергии. Важную роль в формировании пищевой непереносимости к молоку, яйцам, рыбе играют IgG4-АТ (3).Формированию пищевой и лекарственной непереносимости способствует наличие заболеваний желудочно кишечного тракта (ЖКТ): гастрит, хронический холецистит, хронический панкреатит, колит, дисбактериоз кишечника. Определение IgG-АТ к пищевым продуктам методом ИФА (фирма «Биохиммак», «Аллергофарма») целесообразно также при рецидивирующей крапивнице, атопическом дерматите, с наличием сопутствующих заболеваний ЖКТ. При целиакии наблюдается пищевая непереносимость глютен-содержащих продуктов (белок глиадин). В механизме развития задействованы активированные Т-клетки, вырабатывающие ИЛ-2 и другие цитокины (гамма-ИФН, ФНО-альфа, ИЛ-1), синтезируются специфические IgG, M, A-АТ, что приводит к повышению про-ницаемости и повреждению слизистой, а в дальнейшем к развитию атрофии (1).

Псевдоаллергические реакции по клинической симптоматике могут быть сходны с истинными IgE-опосредованными реакциями, но отличаются по механизму развития. Их развитие не связано с выработкой АТ или участием сенсибилизированных лимфоцитов, в патогенезе этих реакций выделяют только две стадии – патохимическую и патофизиологическую (3).

При псевдоаллергических реакциях происходит неспецифическое высвобождение медиаторов: гистамина, лейкотриенов, простагландинов. Вещества, приводящие к высвобождению медиаторов получили название гистаминолибераторов: вещество 48/80, полиамины, вещества, в составе которых имеются NH-группы или алифатическая связь N-гексадефиламид, антибиотики (полимиксин), кальциевые ионофоры, фрагменты комплемента, кровезаменители, продукты жизнедеятельности гельминтов (3).

Для диагностики псевдоаллергических реакций предложены цитометрический аллерген стимулирующий клеточный тест (ЦАСК-тест) и клеточный тест высвобождения медиаторов (FLOW-CAST и EK-CAST). В 2002г. DeWeck A.L., Sanz M.L. показали, что при активации базофилов с помощью аллергена на их поверхности происходит экспрессия CD63 АГ (7). При ЦФСК-тесте (FLOW-CAST) используют двойную метку, выделяют лейкоциты и инкубируют их со стимулирующим буфером и аллергеном, анти IgE МАТ с флюоресцентной меткой для идентификации базофилов, после чего добавляют CD63 МАТ и на поверхности базофилов определяют экспрессию CD63 АГ методом проточной цитометрии. Например, для пищевых и ингаляционных аллергенов тест считается положительным при экспрессии CD63 на поверхности ³15% базофилов; для ядов насекомых - ³ 10%; бета-лактамных антибиотиков и анальгетиков- ³ 5% базофилов и индекс стимуляции ³ 2. Индекс стимуляции равен отношению %CD63+-базофилов в пробе с аллергеном к количеству этих клеток в пробе без аллергена. ЦФСК-тест (FLOW-CAST) был разработан Buhlmann laboratories. Его аналог BASOTEST разработан фирмой Beckton-Dickinson. ЦАСК-тест специфичен для определения IgE-опосредованной аллергии к ингаляционным аллергенам (кожные пробы нельзя проводить), пыльцевым (14), лекарствам, бета-лактамным антибиотикам (9), миорелаксантам (5), анальгетикам (5, 12), аллергии к латексу, укусам перепончатокрылых насекомых (7), псевдоаллергических реакций к противовоспалительным нестероидным препаратам (12), индуцированным компонентами комплемента, плазмой, опаределение аутоантител к IgE (15). Результаты ЦАСК-теста (FLOW-CAST) хорошо коррелируют с результатами кожных проб.

Клеточный тест высвобождения медиаторов (ЕК-CAST) основан на определении сульфолейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4), продуктов распада арахидоновой кислоты, трансформированного 5-липогеназой и глютатион-С-трансферазой после воздействии аллергенов на клетки.Сульфолейкотриены могут синтезироваться базофилами, тучными клетками, макрофагами, эозинофилами, почечными мезенгиальными клетками не только при IgE-опосредованных аллергических реакциях, но и при воспалительных процессах, лекарственной и пищевой непереносимости, псевдоаллергических реакциях. Синтезированный клетками LTC4 метаболизирует до образования LTD4 и LTE4.

Сульфолейкотриены могут определяться в различных биологических жидкостях методом ИФА. Тест считается положительным для пищевых, ингаляционных аллергенов, латекса, ядов насекомых при определении уровня лейкотриенов

³ 200пкг/мл; для лекарственных аллергенов, а также пищевых и химических добавок ³ 40пкг/мл.

Оба теста высоко специфичны для диагностики пищевой аллергии и непереносимости, ингаляционной аллергии, когда кожные тесты не могут быть использованы, аллергии на латекс, на ужаление перепончатокрылыми насекомыми, аллергии у детей, лекарственной аллергии и непереносимости, различных псевдоаллергических реакций.

Могут быть использованы одновременно оба теста (CAST-COMBI) для диагностики лекарственной аллергии, пищевой и лекарственной непереносимости, псевдоаллергических реакций, когда сульфолейкотриены определяют в надосадочной жидкости, а на базофилах – экспрессию CD63 АГ (13).

Применение ЦАСК-теста и клеточного теста высвобождения медиаторов в диагностике пищевой аллергии и непереносимости, псевдоаллергических реакций может быть использовано для составления гипоаллергенной и элиминационной диеты.

Таким образом, применение современных методов диагностики расширяет наши представления о патогенезе и возможностях лечения аллергических заболеваний.